PRÁCTICA No.2:"PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO"

PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO

Esta práctica se llevó a cabo el día lunes y jueves 12 y 15 de marzo 2012, en las instalaciones del laboratorio para prácticas de análisis clínicos del CBTis 199, como parte del programa de 4º semestre para la preparación de la carrera de Laboratorista Clínico, en su subdivisión procesar cultivos bacteriológicos.

OBJETIVO

Conocer los principios generales de las técnicas de esterilización  de materiales de vidrio y medios de cultivo de uso común en Microbiología, así como de observar el efecto y la importancia de las condiciones asépticas en el control de la contaminación microbiana.

FUNDAMENTO

Los microorganismos, como todos los otros seres vivos, son verdaderamente susceptibles a los cambios de las condiciones  ambientales y en la medida en que se han podido adaptar a estos cambios, se han distribuido en una gran diversidad de hábitats incluyendo los de condiciones extremas de tipo físico y químico.

La esterilización se define como la destrucción completa de todos los microorganismos presentes incluyendo las formas vegetativas y las esporas.

Para lograr la destrucción de las bacterias, existen diferentes medios como son: la acción de los agentes químicos y los antibióticos.

Los principales métodos de esterilización empleados en un laboratorio de bacteriología son:

Calor húmedo, seco y filtración para los líquidos, sin olvidar que cuando se requiere una esterilización más completa se efectúa está usando gas (óxido de etileno) y el área de trabajo se expone a los rayos ultravioleta.

Entre los principales métodos físicos se encuentra la acción del calor, el cual puede ser seco o húmedo, considerando que el punto térmico mortal se define como la temperatura necesaria  para producir la muerte de la bacteria en un tiempo determinado.   

El calor húmedo se aplica para esterilizar medios de cultivo, soluciones y cultivos bacterianos que se desechan, siendo el más recomendable el autoclave.

MATERIAL

v  Mechero de Bunsen y Fisher

v  Tripie

v  Tela de asbesto

v  Portaobjetos

v  Cuba de tinción

v  Matraz Erlenmeyer de 250 ml

v  Algodón

v  Gasa

v  Papel estraza

v  Cinta testigo

v  Cajas Petri

v  Olla exprés

v  Asa de siembra

SUSTANCIAS:

Ø  Muestra biológica: heces fecales y orina

Ø  Agar EMB

Ø  Agar Salmonella-Shigella

Ø  Fenol

Ø  Agua destilada

Ø  Colorantes de Gram

Ø  Aceite de inmersión 

PROCEDIMIENTO

1.    Lavar perfectamente dos matraces con escobillón y detergente. Enjuagar con abundante agua corriente

2.    Dejar escurrir y secar sobre una toalla o papel de envoltura.

3.    Pesar con ayuda de una balanza la cantidad necesaria de medio de cultivo de agar EMB y S.S. para 40 ml de agua.

4.    Elaborar con algodón y gasa unos tapones para los matraces, que ajuste con holgura, sobre los que finalmente se colocara un capuchón de papel estraza.

5.    Vaciar 40 ml de agua destilada en el matraz ya seco.

6.    Limpiar el área de trabajo y rociarla con fenol para desinfectarla. Encender el mechero de Bunsen, y colocar sobre este el tripie y encima la tela de asbesto.

7.    Verter el polvo del medio S.S. al matraz, colocar este último sobre la tela de asbesto y disolver calentado. Dejarlo hervir NO MAS DE UN MINUTO

8.    Cuando se alcance el punto de ebullición, bajar el matraz del fuego, flamear el tapón y la boca del matraz, para taparlo y colocarle su capuchón de papel.  Repetir los pasos 5-8 para el medio EMB.

9.    Colocar las cajas de Petri cerca del mechero, y verter en una de ellas el medio S.S. hasta la mitad. Esperar a que solidifique.

10. Esterilizar con autoclave solamente al medio EMB, de la siguiente manera:

a)    En la olla exprés verter agua hasta el nivel indicado (1/3 parte)

b)    Colocar la base dentro de esta y ponerla al fuego (con los mecheros Fisher)

c)    Acomodar los medios y materiales en la base de la olla.

d)    Cerrar la olla y esperar a que la temperatura se eleve

e)    Dejar que se caliente hasta los 121°C o 15 lbs de presión revisando continuamente la escala del manómetro. Una vez alcanzada esta temperatura deberá bajarse el nivel del fuego sacando y metiendo uno de los mecheros.

f)     Mantener así por 15 minutos.

g)    Apagar el fuego y dejar a que la presión descienda a 0.

h)   Abrir cuidadosamente la olla y sacar los medios ya esterilizados.

11. Acercar el medio al área de trabajo, que se mantiene aséptica.

12. Dejar enfriar al medio, hasta una temperatura en la que el matraz caliente pero no queme la piel, y verter suavemente en la caja o cajas Petri el medio de cultivo.

13. Una vez que se tienen solidificados los medios de cultivo, se procede a sembrar en ellos. Se toma el asa, se flamea y se toma un poco de la muestra de heces, para hacer el rayado de la placa en sectores, sembrando en ambos medios. Se flamea nuevamente el asa y se procede a la misma operación pero con la orina.

14. Se dejan incubar en la estufa de incubación por un lapso de 24-48 horas

Preparación de frotis:

1.    Transcurrido este tiempo, sacar los medios de cultivo y hacer la descripción morfológica de las colonias obtenidas en forma cualitativa

2.    Lavar  y secar perfectamente los portaobjetos

3.    Limpiar la mesa o lugar de trabajo con fenol

4.    Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo.

5.    Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos.

6.    Colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extender suavemente en una área circular de 2 cm de diametro aproximadamente o colocar en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada en la que se mezcla una pequeña muestra del cultivo y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar el frotis al aire

7.    Fijar los frotis

8.    Teñir por tinción de Gram

9.    Dejar secar al aire y observar la preparación al microscopio localizando con el objetivo 10x, pasar luego a 40x y observar a detalle con el objetivo 100x, colocando previamente una gota de aceite de inmersión.

RESULTADOS

Al preparar y esterilizar los medios de cultivo se obtuvo una solución homogénea libre de microorganismos, y al verterlas en las cajas y solidificar, el medio S.S. era color rosado y el medio EMB, lucía verde y a trasluz se veía rojizo.

MEDIO SALMONELLA-SHIGELLA

MEDIO EMB

Al sacar los medios con crecimiento, se tuvieron los siguientes resultados:

MEDIO EMB

En el de las heces, había colonias de borde liso, de color violeta con un brillo verde metálico y de relieve convexo, colonias propias de E. coli En el lado de orina, no hubo crecimiento, solo una contaminación por hongo.

MEDIO SALMONELLA-SHIGELLA

En el medio S.S., donde fueron sembradas las heces, hubo un abundante crecimiento, con un cambio de color de rosa al amarillo en el medio, con colonias irregulares, mucoides y sin color, probablemente Shigella spp.

En el medio donde se sembró orina no hubo crecimiento.

OBSERVACIONES

Frotis medio S.S. 100x

Se distinguen con un poco de dificultad en este campo algunos bacilos gramnegativos, algo cortos, probablemente se trate de Shigella dysenteriae

Frotis medio EMB, 100x

Se distinguen perfectamente bacilos gramnegativos, algunos agrupados en palizadas del frotis de la colonia verde metálico, sin duda alguna se trata de  Escherichia coli

CONCLUSIÓN

Al sacar el material de la olla, el trozo de cinta testigo tiene una pequeñas bandas que al reaccionar con calor, se tornan  color negro o gris y es debido a que cuando se expone a un proceso de esterilización por vapor, los reactivos de la cinta cambian su color al reaccionar.

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio.

El material alimenticio en el que crecen los microorganismos se llama medio de cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el cultivo.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son:

§      Temperatura

§      Grado de humedad  

§      Presión de oxígeno adecuado

§      Un grado correcto de acidez o alcalinidad

§      Contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios

§      Debe estar exento de todo microorganismo contaminante

Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes, dependiendo de las necesidades y exigencias de las bacterias.

Fuentes consultadas:

·         Métodos de esterilización, consultado el día 17 de marzo del 2012, en http://www.monografias.com/trabajos10/meste/meste.shtml

·         Medios de cultivo en Microbiología, consultado el día 17 de marzo 2012 en http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm

PRÁCTICA No. 1: "PREPARACIÓN, FIJACIÓN Y COLORACIÓN SIMPLE DE FROTIS"

SEP                                      DGETI                                SEMS

CENTRO DE BACHILLERATO TECNOLÓGICO INDUSTRIAL Y DE SERVICIOS NO. 199

“EMILIANO ZAPATA SALAZAR”

MIXQUIAHUALA, HGO.

  

PROCESAR CULTIVOS BACTERIOLÓGICOS

PROFESOR: DR. VICENTE MARTÍNEZ FRAGOSO

ALUMNO: EDGAR URIEL RODRÍGUEZ MUÑOZ

GRADO: 4° SEMESTRE                                   GRUPO: DM

ESPECIALIDAD: LABORATORISTA CLÍNICO

SEMESTRE: ENERO-JULIO 2012

PREPARACIÓN, FIJACIÓN Y COLORACIÓN SIMPLE DE FROTIS

Esta práctica se llevó a cabo el día lunes 5 de marzo 2012, en las instalaciones del laboratorio para prácticas de análisis clínicos del CBTis 199, como parte del programa de 4º semestre para la preparación de la carrera de Laboratorista Clínico, en su subdivisión procesar cultivos bacteriológicos.

OBJETIVO

 Aprender las técnicas de preparación del frotis, de fijación y coloración más utilizadas en el estudio macroscópico de cultivos bacterianos, para poder así dar pauta a la identificación de las principales formas bacterianas y comprender la importancia de las tinciones y su adecuado uso.

FUNDAMENTO

Debido al pequeño tamaño de la mayoría de los microorganismos, se requiere de un microscopio óptico, ya sea de campo claro o de campo oscuro para poder realizar la descripción de estos.

El microscopio más común es el de campo claro, en el cual la observación de células vivas es limitada, debido a que estas son incoloras y permiten el paso de un gran cantidad de luz.

Debido a este factor, la observación de frotis teñido es más recomendable.

Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados.

Los frotis de cultivos líquidos se deberán fijar con alcohol para evitar residuos del medio que al quemarse darán interferencias en las observaciones y los de colonias de medios sólidos se fijan generalmente con calor. 

MATERIAL

v  Mechero de Bunsen

v  Asa de siembra

v  Portaobjetos

v  Microscopio

v  Pizeta

v  Tubos de ensayo

v  Centrifuga 

SUSTANCIAS:

Ø  Muestra biológica: heces fecales frescas y orina

Ø  Cultivos bacterianos

Ø  Azul de metileno

Ø  Alcohol etílico

Ø  Fenol

Ø  Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO

1.    Analizar macroscópicamente al medio de cultivo

2.    Llenar a la mitad un tubo de ensayo con agua destilada. Tomar un aplicador e introducirlo a la muestra de heces, tomando lo mas mínimo posible de estas y disolver en el tubo con agua.

3.    Tomar un poco de orina, depositarla en otro tubo de ensayo y centrifugar durante 5 minutos a 3 000 rpm.

Preparación de frotis:

1.    Lavar  y secar perfectamente los portaobjetos

2.    Limpiar la mesa o lugar de trabajo con fenol

3.    Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo.

4.    Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. Despues acercar al mechero el tubo de cultivo, quitarle el tapon y flamear rapidamente la boca del mismo, introducir el asa en el tubo de cultivo y tomar cuidadosamente la muestra (En esta practica no se trabajo con cultivos liquidos).

5.    Para el caso de cultivos liquidos, colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extender suavemente en una área circular de 2 cm de diametro aproximadamente y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar el frotis al aire

6.    Si el cultivo es en medio solido, previamente se colocará en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada en la que se mezcla una pequeña muestra del cultivo que se toma siguiendo las indicaciones del paso 4, extenderla suavemente y dejar secar al aire

7.    Del tubo de agua con un poco de heces disueltas, se flamea el asa, se deja enfriar y se mete al tubo para tomar un poco de la suspension, que posteriormente se extiende en el portaobjetos.

8.    Si hay sedimento en la orina, se decanta y se extiende el sedimento en el portaobjetos, con ayuda del asa previamente flameada.

Fijación del frotis:

1.    Fijar los frotis de cultivos líquidos con dos gotas de metanol o etanol absoluto y dejar secar al aire (hacer esto en zonas alejadas del mechero)

2.    Los frotis de cultivos sólidos, completamente secos se fijaran con calor. Para esto se pasará el frotis rápidamente 2-3 veces en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero

3.    Palpar la parte inferior del portaobjetos con el dorso de la mano izquierda para enfriar y comprobar que no hubo sobrecalentamiento.

Tinción simple:

1.    Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto

2.    Eliminar el exceso de colorante con lavado suave al agua corriente o con la ayuda de la pizeta con agua.

3.    Dejar secar al aire

4.    Observar la preparación al microscopio localizando con el objetivo 10x, pasar luego a 40x y observar a detalle con el objetivo 100x, colocando previamente una gota de aceite de inmersión.

OBSERVACIONES

En el medio de cultivo agar sangre, se encontraban colonias puntiformes, blanquecinas, lisas, además de que eran hemolíticas del tipo B.

En el otro medio (amarillo) las colonias eran semejantes.

Frotis cultivo agar sangre 100x

Todo el campo se encontraba repleto de bacterias de morfología parecida a los cocos pero un poco alargados, agrupados en sarcinas, por ser cultivo de exudado vaginal, se trataba de Gardnerella vaginalis

Frotis heces 100x

Muchos residuos de alimentos, bastoncillos cortos (E. coli) y además destaca lo que parecía ser un huevecillo, que por su morfología semejaba al de tenia

Frotis orina, 100x

Distinguimos células epiteliales de las vías urinarias, que se desprenden en la micción, pero además en la que está ubicada aproximadamente a las 10, se encuentran bacilos que la rodean, probablemente Escherichia coli

RESULTADOS

En el frotis de orina y heces se encontraron bacilos cortos, tratándose de Escherichia coli, una bacteria que por lo regular habita el tracto gastrointestinal del ser humano, por lo tanto es común encontrarla en heces.

Sin embargo en orina, no es tan común, pues la mayoría de las veces se encuentra E. coli en la orina a causa de infección bacteriana.

En el medio de cultivo, en el cual había sido sembrado exudado vaginal se tomó de la colonia que estaba en el agar sangre, y tomando en cuenta las características macroscópicas y microscópicas, se determinó que se trataba de la bacteria Gardnerella vaginalis.

Gardnerella vaginalis se trata de una bacteria que es capaz en la mujer producir un cuadro clínico irritativo con flujo vaginal (vaginitis), y en algunos casos en el hombre balanitis (inflamación en la cabeza del pene).

Es un bacilo inmóvil no encapsulado, puede presentar fimbrias y es corto con una longitud de 0.5. - 1.5 mm, lo que hace que parezca un cocobacilo pleomórfico, que usualmente se tiñe como Gramnegativo o Gram variable. Es un organismo anaerobio, presenta hemolisis del tipo beta en agar sangre humana. Son cataliza y oxidasa negativo.

Esta bacteria se va a poder aislar en agar, sangre incubado en anaerobiosis o en una atmósfera de 5% de CO2 a 35°c por 48 horas.

Se originan colonias translucida u opacas de 0.3 a 0.5 mm de diámetro, puntiforme, redondas, lisas, con hemolisis tipo beta.

CONCLUSIÓN

Para hacer un frotis debe utilizarse un portaobjetos limpio y desengrasado. Si el cultivo proviene de un medio líquido, se transfiere con ansa una gota del mismo y se extiende hasta formar una fina película que cubra el centro del portaobjetos. Si el cultivo proviene de un medio sólido, se procede a colocar una gota de agua en el centro del portaobjetos, se flamea el asa, se deja enfriar y luego se extiende la suspensión bacteriana hasta formar una fina película sobre el portaobjetos sin tocar y esperar a que se seque.

Esperar hasta que el líquido se evapore o bien acelerar el proceso acercando el portaobjeto al aire caliente de la llama del mechero.

La fijación se efectúa para que los microorganismos queden adheridos al vidrio y no se desprendan del portaobjetos con los lavados a los que hay que someterlos posteriormente. La fijación coagula las sustancias proteicas de las células, lo cual hace que los microorganismos queden pegados al portaobjetos. Con este procedimiento no mueren todas las bacterias.

Existen dos tipos de fijación:

Con calor (o método de Koch): El procedimiento ideado por Koch consiste en pasar lentamente el preparado por la llama del mechero 3 veces seguidas, con la precaución de llevar el extendido hacia arriba. El inconveniente de este método es que los microorganismos pueden deformarse demasiado si el calentamiento resulta excesivo. Después del procedimiento, el portaobjetos debe tornarse caliente pero no debe quemar cuando se coloca en la parte posterior de la mano.

Fijación química: La coagulación del protoplasma microbiano con sustancias químicas es lo ideal pues las células no resultan deformadas. Para su realización, existen varios métodos: se inunda el preparado con alcohol metílico, se deja actuar 3 minutos y se lava con agua. Es el más usado.

Con el otro método se inunda el extendido con licor de Hoffman (partes iguales de etanol absoluto y éter sulfúrico) y se deja actuar hasta su evaporación completa.

Con la coloración o tinción se hacen actuar sobre el preparado ya fijado las soluciones de colorantes de acuerdo al método de tinción que se realice. Se clasifican en:

Simples: Se entiende por tinción (o coloración) simple al teñido de los microorganismos aplicando sólo una solución colorante. Este tipo de tinciones pueden ser

Positivas: es la tinción de los microorganismos, efectuada con colorantes básicos que poseen afinidad por los constituyentes celulares y se combinan químicamente con el citoplasma microbiano. La coloración consiste en cubrir el frotis, después de fijado, con la solución colorante y se deja actuar el tiempo preciso. Luego se lava con agua y se deja secar. Algunas sustancias colorantes simples son:

·         fucsina básica

·         violeta de genciana

·         azul de metileno

Negativas: los microorganismos quedan sin teñir y se colorea el medio que los rodea. Por lo tanto, lo que se ve es el perfil de las células. La sustancia usada para la tinción negativa es un colorante opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea a las células, tal como:

v  Tinta china

v  Colorantes ácidos (nigrosina)

La coloración negativa es un modo satisfactorio para revelar estructuras como:

§      cápsulas

§      esporas

§      espiroquetas

Compuestas o diferenciales: Aunque existen múltiples tipos de tinciones, aquí vamos a referirnos a los dos métodos decoloración compuesta más comúnmente empleados en la práctica corriente del laboratorio de microbiología: la tinción de Gram y la de Ziehl-Neelsen. Estas coloraciones permiten diferenciar las bacterias incluso cuando tienen igual forma y tamaño, por esta razón es una “tinción diferencial”.

Fuentes consultadas:

·         Gardnerella vaginalis, consultado el día 5 de marzo del 2012, en http://html.rincondelvago.com/gardnerella-vaginalis.html

·         Preparación de frotis bacteriano, consultado el día 6 de marzo 2012 en http://www.joseacortes.com/practicas/frotisbact.htm

·         Manual práctico de Microbiología ambiental, consultado el 8 de marzo 2012 en http://es.scribd.com/doc/57234084/27/TINCION-SIMPLE 

Hola a todos!!!! He creado este nuevo blog para publicar exclusivamente en el mis practicas de Procesar Cultivos Bacteriologicos o Enterobacterias como nos gusta decirle a mi y mis compañeros, bueno espero y no las haga mal...