PRÁCTICA No.2:"PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO"

PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO

Esta práctica se llevó a cabo el día lunes y jueves 12 y 15 de marzo 2012, en las instalaciones del laboratorio para prácticas de análisis clínicos del CBTis 199, como parte del programa de 4º semestre para la preparación de la carrera de Laboratorista Clínico, en su subdivisión procesar cultivos bacteriológicos.

OBJETIVO

Conocer los principios generales de las técnicas de esterilización  de materiales de vidrio y medios de cultivo de uso común en Microbiología, así como de observar el efecto y la importancia de las condiciones asépticas en el control de la contaminación microbiana.

FUNDAMENTO

Los microorganismos, como todos los otros seres vivos, son verdaderamente susceptibles a los cambios de las condiciones  ambientales y en la medida en que se han podido adaptar a estos cambios, se han distribuido en una gran diversidad de hábitats incluyendo los de condiciones extremas de tipo físico y químico.

La esterilización se define como la destrucción completa de todos los microorganismos presentes incluyendo las formas vegetativas y las esporas.

Para lograr la destrucción de las bacterias, existen diferentes medios como son: la acción de los agentes químicos y los antibióticos.

Los principales métodos de esterilización empleados en un laboratorio de bacteriología son:

Calor húmedo, seco y filtración para los líquidos, sin olvidar que cuando se requiere una esterilización más completa se efectúa está usando gas (óxido de etileno) y el área de trabajo se expone a los rayos ultravioleta.

Entre los principales métodos físicos se encuentra la acción del calor, el cual puede ser seco o húmedo, considerando que el punto térmico mortal se define como la temperatura necesaria  para producir la muerte de la bacteria en un tiempo determinado.   

El calor húmedo se aplica para esterilizar medios de cultivo, soluciones y cultivos bacterianos que se desechan, siendo el más recomendable el autoclave.

MATERIAL

v  Mechero de Bunsen y Fisher

v  Tripie

v  Tela de asbesto

v  Portaobjetos

v  Cuba de tinción

v  Matraz Erlenmeyer de 250 ml

v  Algodón

v  Gasa

v  Papel estraza

v  Cinta testigo

v  Cajas Petri

v  Olla exprés

v  Asa de siembra

SUSTANCIAS:

Ø  Muestra biológica: heces fecales y orina

Ø  Agar EMB

Ø  Agar Salmonella-Shigella

Ø  Fenol

Ø  Agua destilada

Ø  Colorantes de Gram

Ø  Aceite de inmersión 

PROCEDIMIENTO

1.    Lavar perfectamente dos matraces con escobillón y detergente. Enjuagar con abundante agua corriente

2.    Dejar escurrir y secar sobre una toalla o papel de envoltura.

3.    Pesar con ayuda de una balanza la cantidad necesaria de medio de cultivo de agar EMB y S.S. para 40 ml de agua.

4.    Elaborar con algodón y gasa unos tapones para los matraces, que ajuste con holgura, sobre los que finalmente se colocara un capuchón de papel estraza.

5.    Vaciar 40 ml de agua destilada en el matraz ya seco.

6.    Limpiar el área de trabajo y rociarla con fenol para desinfectarla. Encender el mechero de Bunsen, y colocar sobre este el tripie y encima la tela de asbesto.

7.    Verter el polvo del medio S.S. al matraz, colocar este último sobre la tela de asbesto y disolver calentado. Dejarlo hervir NO MAS DE UN MINUTO

8.    Cuando se alcance el punto de ebullición, bajar el matraz del fuego, flamear el tapón y la boca del matraz, para taparlo y colocarle su capuchón de papel.  Repetir los pasos 5-8 para el medio EMB.

9.    Colocar las cajas de Petri cerca del mechero, y verter en una de ellas el medio S.S. hasta la mitad. Esperar a que solidifique.

10. Esterilizar con autoclave solamente al medio EMB, de la siguiente manera:

a)    En la olla exprés verter agua hasta el nivel indicado (1/3 parte)

b)    Colocar la base dentro de esta y ponerla al fuego (con los mecheros Fisher)

c)    Acomodar los medios y materiales en la base de la olla.

d)    Cerrar la olla y esperar a que la temperatura se eleve

e)    Dejar que se caliente hasta los 121°C o 15 lbs de presión revisando continuamente la escala del manómetro. Una vez alcanzada esta temperatura deberá bajarse el nivel del fuego sacando y metiendo uno de los mecheros.

f)     Mantener así por 15 minutos.

g)    Apagar el fuego y dejar a que la presión descienda a 0.

h)   Abrir cuidadosamente la olla y sacar los medios ya esterilizados.

11. Acercar el medio al área de trabajo, que se mantiene aséptica.

12. Dejar enfriar al medio, hasta una temperatura en la que el matraz caliente pero no queme la piel, y verter suavemente en la caja o cajas Petri el medio de cultivo.

13. Una vez que se tienen solidificados los medios de cultivo, se procede a sembrar en ellos. Se toma el asa, se flamea y se toma un poco de la muestra de heces, para hacer el rayado de la placa en sectores, sembrando en ambos medios. Se flamea nuevamente el asa y se procede a la misma operación pero con la orina.

14. Se dejan incubar en la estufa de incubación por un lapso de 24-48 horas

Preparación de frotis:

1.    Transcurrido este tiempo, sacar los medios de cultivo y hacer la descripción morfológica de las colonias obtenidas en forma cualitativa

2.    Lavar  y secar perfectamente los portaobjetos

3.    Limpiar la mesa o lugar de trabajo con fenol

4.    Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo.

5.    Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos.

6.    Colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extender suavemente en una área circular de 2 cm de diametro aproximadamente o colocar en el centro del portaobjetos una gota de agua destilada en la que se mezcla una pequeña muestra del cultivo y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar el frotis al aire

7.    Fijar los frotis

8.    Teñir por tinción de Gram

9.    Dejar secar al aire y observar la preparación al microscopio localizando con el objetivo 10x, pasar luego a 40x y observar a detalle con el objetivo 100x, colocando previamente una gota de aceite de inmersión.

RESULTADOS

Al preparar y esterilizar los medios de cultivo se obtuvo una solución homogénea libre de microorganismos, y al verterlas en las cajas y solidificar, el medio S.S. era color rosado y el medio EMB, lucía verde y a trasluz se veía rojizo.

MEDIO SALMONELLA-SHIGELLA

MEDIO EMB

Al sacar los medios con crecimiento, se tuvieron los siguientes resultados:

MEDIO EMB

En el de las heces, había colonias de borde liso, de color violeta con un brillo verde metálico y de relieve convexo, colonias propias de E. coli En el lado de orina, no hubo crecimiento, solo una contaminación por hongo.

MEDIO SALMONELLA-SHIGELLA

En el medio S.S., donde fueron sembradas las heces, hubo un abundante crecimiento, con un cambio de color de rosa al amarillo en el medio, con colonias irregulares, mucoides y sin color, probablemente Shigella spp.

En el medio donde se sembró orina no hubo crecimiento.

OBSERVACIONES

Frotis medio S.S. 100x

Se distinguen con un poco de dificultad en este campo algunos bacilos gramnegativos, algo cortos, probablemente se trate de Shigella dysenteriae

Frotis medio EMB, 100x

Se distinguen perfectamente bacilos gramnegativos, algunos agrupados en palizadas del frotis de la colonia verde metálico, sin duda alguna se trata de  Escherichia coli

CONCLUSIÓN

Al sacar el material de la olla, el trozo de cinta testigo tiene una pequeñas bandas que al reaccionar con calor, se tornan  color negro o gris y es debido a que cuando se expone a un proceso de esterilización por vapor, los reactivos de la cinta cambian su color al reaccionar.

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio.

El material alimenticio en el que crecen los microorganismos se llama medio de cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el cultivo.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son:

§      Temperatura

§      Grado de humedad  

§      Presión de oxígeno adecuado

§      Un grado correcto de acidez o alcalinidad

§      Contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios

§      Debe estar exento de todo microorganismo contaminante

Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes, dependiendo de las necesidades y exigencias de las bacterias.

Fuentes consultadas:

·         Métodos de esterilización, consultado el día 17 de marzo del 2012, en http://www.monografias.com/trabajos10/meste/meste.shtml

·         Medios de cultivo en Microbiología, consultado el día 17 de marzo 2012 en http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm